荧光光谱是指某些物质经某波长入射光照射后,分子从能级Sa被激发至能级Sb,并在很短时间内去激发从Sb返回Sa,发出波长长于入射光的荧光。
荧光光谱原理[编辑]
设分子能级为基态Sa,激发态Sb。
分子在能级Sa和Sb上的分布按照波尔兹曼分布规律:
![{\displaystyle n_{b}/n_{a}=e^{-(E_{b}-E_{a})}=e^{-h\nu /kT}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/60212b49fe8b1fa9977a6ba183633c4cded31ac2)
基态上分子数目变化速率为
![{\displaystyle -{\frac {dn_{a}}{dt}}=I(\nu )n_{a}B_{ab}-I(\nu )n_{b}B_{ba}-n_{b}A_{ba}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/e3f9902c03126c38bf104f02433fc5055289ccb1)
平衡时(稳定态),上式为0:
又有:
迁移几率(爱因斯坦系数)
![{\displaystyle B_{ab}=B_{ba}={\frac {2\pi }{3\hbar ^{2}}}D_{ab}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/4640d2da758dbe05015298350fc0acf2d008b93f)
偶极强度
![{\displaystyle D_{ab}=\mid <\psi _{b}\mid {\underline {\mu }}\mid \psi _{a}>\mid }](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/dd4261822a9078be6d8ed783a507f4f6d72d8ea5)
频率ν处的入射光强
![{\displaystyle I(\nu )={\frac {8{\pi }h{\nu ^{3}}}{c^{3}(e^{h{\nu }/kT}-1)}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/0dff6b7fc61ff8d7467f44087bdad161429b67bf)
推导出:
Sb通过发射光子从回到Sa的几率,即衰减常数λ
![{\displaystyle A_{ba}=({\frac {32{\pi ^{3}}{\nu ^{3}}}{3c^{3}\hbar }})\mid <\psi _{b}\mid {\underline {\mu }}\mid \psi _{a}>\mid }](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/e0ccc4d0743bc6f08339307625dd27645c0bd296)
Sb上的分子去激发速率
![{\displaystyle {\frac {dn_{b}}{dt}}=-A_{ba}n_{b}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/5c2fa2ad1f27fba5818b328961a0b2f352521b46)
上式的一个解为
![{\displaystyle n_{b}(t)=n_{b}(0)e^{-A_{ba}t}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/cf037195c93ebc0d6635debe1bb295ae6b97d4ff)
可见激发态上的分子数目以指数形式衰减,衰减常数为Aba
Sb的辐射寿命为(此处参考指数衰减)
![{\displaystyle \tau _{R}={\frac {1}{A_{ba}}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/fc04c07aa13e01e5b657364aecae57679302143e)
此仅当吸收的光子和随后发射的光子相同时候有效,即全部吸收的光能量通过辐射过程全部发出光子消耗掉。
而实测时激发态寿命很少和上述寿命一致,因为激发态除了直接发射光子外有很多其他途径失去能量。
Sb通过发出荧光回到Sa的过程的反应速率,即固有荧光速率常数 kF
![{\displaystyle k_{F}=A_{ba}={\frac {1}{\tau _{R}}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/f36ca0acd273b7dbf66b4e248ac8985a7d3c44cb)
Sb回到Sa的其他非辐射途径包括内转变,系统间转变,猝熄作用,其速率常数分别为kIC,kIS,kQ[Q]
则Sb总的去激化(熄灭)常数为kF+kIC+kIS+kQ[Q]
荧光量子产率
![{\displaystyle \phi _{F}={\frac {k_{F}}{k_{F}+k_{I}C+k_{I}S+k_{Q}[Q]}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/c8279eda716bf8df8779f098daf8a44675453c7b)
也可以写作发射光子数/吸收光子数,即发射的荧光光子数/入射光照射时的吸收量
因为大量的非辐射过程的存在,所以激发态实际衰减时间远小于理想的辐射寿命τR
描述此动力学过程
![{\displaystyle -{\frac {d[S_{b}]}{dt}}=(k_{F}+k_{I}C+k_{I}S+k_{Q}[Q])[S_{b}]}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/88079b6ee87943a607072815fd16dda15373899a)
此方程的一个解为
![{\displaystyle S_{b}(t)=S_{b}(0)e^{-t/\tau _{F}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/c8835620bf3d3f12b086a6dc651cd4cebdf28eac)
Sb是激发态上的分子数
斯托克斯位移[编辑]
吸收曲线的0,0跃迁与发射曲线的0,0跃迁不重合,之间有一位移,荧光光谱较相应的吸收光谱红移。
原因是分子在处于激发态期间进行了重定向/重排布,消耗了能量,故荧光光谱的0,0峰向低能量(高波长)方向平移。
荧光强度[编辑]
![{\displaystyle A=\epsilon cl=lg{\frac {I_{0}}{I}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/dc5418ffaf49bf8d54aea5d3de70468bff9b9684)
得到
![{\displaystyle I=I_{0}e^{-2.303\epsilon cl}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/caf9759b70511bbb7d83b0b945c154debe32667b)
观测发射强度为
![{\displaystyle F(\lambda )=2.303\epsilon clI_{0}\phi _{F}f(\lambda )d=\epsilon \phi _{F}f(\lambda )cI_{0}k}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/79725a3445ff2d8b7811c8a3d931fb61c3ae73f4)
k=2.303ld
给一束脉冲入射光后,发射光在脉冲后的时间t时的强度I(t),与激发态的衰减率dSb/dt及激发态通过荧光衰减的比率φF(量子产率)成比例:
![{\displaystyle I(t)={\frac {dS_{b}}{dt}}\phi _{F}=S_{b}(0)({\frac {\phi _{F}}{\tau _{F}}}e^{-t/\tau _{F}}=k_{F}S_{b}(0)e^{-t/\tau _{F}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/186822d7c074ad2d820162469572c3b3e349e8b7)
随时间表现为指数衰减
系统内有一种荧光物质时:
![{\displaystyle E_{m}(t)=Ae^{-t/\tau _{F}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/124e1822c509b39542a18ab3de733b265746a43d)
系统中有两种荧光物质时:
![{\displaystyle E_{m}(t)=A_{1}e^{-t/\tau _{1F}}+A_{2}e^{-t/\tau _{2F}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/a9ece19a32263ae1528c053f6ec30ac1d919c68a)
Em是荧光强度,上述公式为荧光衰减(decay)公式
内部滤光效应[编辑]
对高浓度溶液而言,荧光的再吸收不能忽略。大部分入射光在系统前半部分被吸收,发射的荧光被再吸收,只有少量的荧光通过狭缝入射到荧光探测器上,使得探测到的荧光强度减少。
外环境影响[编辑]
去激发同样可能由于碰撞或和溶剂分子的混合导致,以速率kQ[Q]发生。和其他过程不同,考虑碰撞时此猝熄是一个双分子过程。
Sb + Q → Sa + Q (kQ[Q])
因为Q通常浓度远大于Sb ,此过程被视为一个伪一级反应,kQ[Q]的值可通过变化猝熄剂Q的浓度,观察对φF的影响测得。芳香类发色基的辐射寿命通常为1*10-9到100*10-9秒。因此,相比较而言,猝熄过程是相当有效率的。普遍的猝熄剂如O2和I-离子,每和激发态分子碰撞一次就会使其去激发一次。此反应速率仅被扩散限制。在微摩尔浓度猝熄剂下,碰撞发生速率为108每秒,因此可以观察到明显的猝熄。
![{\displaystyle {\frac {F_{0}}{F}}={\frac {\phi _{0}}{\phi }}={\frac {k_{F}+k_{I}C+k_{I}S+k_{Q}[Q]}{k_{F}+k_{I}C+k_{I}S}}=1+k_{Q}[Q]}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/d31d14808b92ddadf6861c85e06680379fcab731)
τ0可测,以F0/F对[Q]作图求得kQ
荧光共振能量迁移[编辑]
简称FRET,此过程适用与计算两端带发色基的高分子长度。
存在供体D和受体A,当光入射时,激发基态供体Da→Db,Db又去激发,通过共振将能量传递给Aa,使得Aa→Ab。
定义迁移效率(E)是Db去激发传递能量到Aa占总Db去激发的比例
![{\displaystyle E={\frac {k_{T}}{k_{T}+k_{F}^{D}<+k_{I}C^{D}<+k_{I}S^{D}}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/e3e1c1f55afa6ddcb62e39c557ecf4c9884715d6)
通过一系列复杂的计算和变化,此处省略,得:
![{\displaystyle k_{T}={\frac {1}{\tau _{0}}}{\frac {R_{0}}{R}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/d115f0b1cbc391f6f5c8aee52e1a46fa84e65ee3)
![{\displaystyle R_{0}=9.7*10^{3}(J\kappa ^{2}n^{-4}\phi _{D})^{\frac {1}{6}}cm}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/4be73d12120eb2e3d17c88c5c43379624da3210f)
![{\displaystyle J=\int \epsilon (\nu )f_{D}(\nu )\nu ^{-4}\,d\nu }](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/09fc81aa5c53ca37f3fe01e23396e957f506d1da)
推导出:
![{\displaystyle E={\frac {R_{0}^{6}}{R_{0}^{6}+R^{6}}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/eae52fd513bb207ed2f67144766136fac9e4de66)
这里R0对一个固定的化学系统而言是常数,R是供体和受体之间的距离,R越接近R0,测计算越精确。
此外计算E的方法有:
![{\displaystyle {\frac {\phi _{D+A}}{\phi _{D}}}=1-E}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/83b529d16ae7a276851a621f0e15cb3555ea034a)
![{\displaystyle {\frac {F_{D+A}}{F_{A}}}=1+{\frac {\epsilon _{D}c_{D}}{\epsilon _{A}c_{A}}}E}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/838e8667b0eebf735120266a312fb9aec3ffcc28)
![{\displaystyle {\frac {\tau _{D,A}}{\tau _{D}}}=1-E}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/a6385ff46ea76f1fcfd6cd6f9ec36efa03bd0276)
参考文献[编辑]
- C.P Cantor & P.R. Schimmel, BIOPHYSICAL CHEMISTRY, Part II. Techniques for the study of biological structure and function. Page 433-465.