透明骨骼标本

雨印鲷的透明骨骼标本

透明骨骼标本(Diaphonization)[1] （页面存档备份，存于互联网档案馆）是使用各种染色方法制备的标本，以观察生物体的骨架。通常使用亚里西安蓝（Alcian blue）和茜素（Alizarin和1,2-二羟基蒽醌）。

对于小动物和胚胎来说，它是一种有效的观察工具，通过解剖很难使骨骼标本处于干燥状态。它已被广泛用于分类学，比较解剖学和胚胎学等研究领域。

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  茜素红　（alizarin red）
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  亚里西安蓝（alcian blue）

被亚里西安蓝染色的C3H-10T1/2 细胞在不同氧压所表现的情况

概述

脊椎动物分类学和相关解剖学研究的重要因素就是骨骼形态学，为了观察骨骼，自古以来就开始以物理方式去除骨骼以外的软组织去制作骨骼标本。

不过，很难为小鱼和发育中的胚胎制作骨骼标本。因为无法避免对骨骼，尚未发育的软骨组织和精细骨骼之间的三维排列的伤害。虽然X光摄影也可用于观察精细骨骼，但是难以观察到三维结构以及软骨。

在透明骨架标本中，通常骨头用茜素染色，软骨是由透明软组织与亚里西安蓝，或双染色进行染色后获得的。在其透明构造中可以清楚观察到肉体中染色的骨架，这就可以克服上述缺点。

此外，组织的透明化处理不仅限在骨骼样品上，而是通用于各种技术的样品上，例如免疫染色和萤光观察。

方法

日本鱿鱼（ジンドウイカ）的染色标本。没有特定的结构被染色，所以整体呈现青蓝色。

有几种制备透明骨骼标本的方法和试剂，但较具有代表性的方法和使用试剂如下所示。

固定

首先，使用醛类固定剂如福马林固定样品的蛋白质，以在蛋白质分子和蛋白质分子之间形成交叉链接。固定后自福马林溶液取出，以流动水源将福马林溶液洗净。

染色

接下来，用亚里西安蓝染色软骨结构。亚里西安蓝具有酸性多糖的结构，使其易和硫酸软骨素中的硫酸基结合的蓝色染料。硫酸软骨素是软骨中常含的一种黏多糖（糖胺聚糖）。所以，软骨部分被染成蓝色。然而，由于黏多糖（糖胺聚糖）不一定仅位于软骨，因此一些标本可能看起来是非特异性染色。

例如，如果由于骨骼的钙质过度流失而导致磷酸钙（磷灰石）的损失，则需要花费很长时间才能让软骨染色溶液染色较为明显，而后者提到的骨染色失败，则是骨骼外基质的黏多糖（糖胺聚糖）占主要部分，使得用亚里西安蓝染色时，整个骨架就像是软骨一样被染成蓝色。

接下来，用茜素染色骨头。茜素是紫色颜料，但与金属离子结合形成红色。磷酸钙（磷灰石）晶体沉积在骨骼上，这些晶体中的钙离子和茜素结合在一起，使得骨头被染成红色。就像亚里西安蓝一样，茜素与金属离子结合，因此尽管只是骨骼骨骼系统的一部分的鱼鳞，仍会因为钙沉积被染成红色。

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  使用红茜素染色以用于研究大鼠胚胎骨
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  被茜素染色的幼年雄鸡鱼（Nematistius pectoralis）由萤光灯照射。
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  Johannes Vermeer, Christ in the House of Martha and Mary, 1654-56. 玛丽的红色上衣使用的是茜素或紫红素
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  茜素的颜色

透明化

标本在碱性水溶液：氢氧化钠、氢氧化钾或者是使用蛋白酶的水溶液的情况下，他们会水解蛋白质的肽键。

在蛋白质分子和蛋白质分子之间，由于侧链氨基已经和福马林形成交叉链接，因此保留了分子间交叉链接的结构，并且组织变得适度地微弱而留下外形。最后，当用甘油置换该样品中的水时，软组织几乎呈现完全透明，并且可以从外部轻易地观察到被染成红色的骨骼和被染成蓝色的软骨。

在此方法中，难以处理含有较为发达的脂肪层的动物，但是可以透过二甲苯来达成脱脂作用。

此外，对七鳃鳗用亚里西安蓝染色通常是不成功的，因其含有较多的脂肪量。

参考文献

• Dingerkus G, Uhler LD.(1977)　Enzyme clearing of alcian blue stained whole small vertebrates for demonstration of cartilage.Stain Technol. 52(4):229-232.